细胞侵袭实验准备程序

产品货号：B-P-00002-2、B-P-00002-4、B-P-00002-10

A、试剂准备:

1、C缓冲溶液 (0.5 X) 制备 : 使用37 ℃水浴回温的无血清细胞培养液 (例如: 无血清DMEM等，用于稀释A胶) 稀释C缓冲溶液 (10 X) 至C缓冲溶液 (0.5 X), 即体积稀释20倍。使用前放置37度水浴槽。 (例如:1 mL C缓冲溶液 (10 X) + 19 ml 无血清DMEM; 如未使用完毕，可保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A胶 (1X) 制备 : 将 A胶 (2X) 置于37 ℃水浴槽回温10分钟，确认完全溶解。再将37 ℃水浴回温的无血清细胞培养液取 0.5 mL，加至37 ℃已溶解的 0.5 mL A胶 (2X)，配置成1 mL 的 A胶 (1X)。使用前置于37度，可降低A胶黏度。(单次使用，勿重复冷冻解冻 A胶 (1X) )

B、细胞侵袭实验步骤

1、准备适用24孔板的Transwell装置。

2、用37 ℃已回温的C缓冲溶液 (0.5 X)将A胶 (1X) 原液体积稀释5-20倍，建议一开始可选用15倍。 (根据细胞种类做稀释比例对比实验，找出最适合自己实验体系的稀释倍数，稀释倍数越高，胶体越软，越容易穿透)

3、根据Transwell上室底部面积加入步骤2的 0.1 mL 稀释后的A胶稀释液到Transwell上室中。

4、将步骤4在 4 ℃ 冰箱孵育2-3小时。

5、在Transwell上室中加入0.1 mL 无血清的细胞悬液，使细胞最终浓度约7.5 x 104 cells/well.。

6、在Transwell下室中加入0.8 mL 含10 %血清的细胞培养液做为chemoattractant，吸引细胞进行迁移及分泌基质蛋白酶 (MMP) 侵袭。 (对照组为Transwell下室中加入含0.8ml无血清的细胞培养液)。

7、将细胞培养板在37 ℃, 5 % CO2培养箱孵育24-48 小时。

8、移除培养液，以PBS 清洗2次。

9、用棉签轻轻擦掉上层未迁移的细胞。

10、加入1 ml 100 % 甲醇室温固定30分钟,再以PBS 清洗2次。

11、加入 1 ml 0.1 % 结晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 结晶紫) 室温染色20 分钟，再以PBS 清洗2次。

12、将Transwell移至载玻片上，在显微镜下随机6-9个视野观察计算迁移的细胞数。