背景^[1-3]

小鼠骨髓巨噬细胞是取自小鼠骨髓的巨噬细胞，主要用巨噬细胞的体外培养研究实验。巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的关键组成部分，并且由于其强大的吞噬病原微生物活性，它们是抵御外来入侵者的第一道防线。巨噬细胞广泛分布于全身，存在于淋巴器官，肝脏，肺，胃肠道，中枢神经系统，骨骼和皮肤中。由于他们的重新分配，参与了广泛的生理和病理过程。

巨噬细胞是高度通用的细胞，能够识别微环境改变并维持组织稳态。许多病原体已经进化出通过巨噬细胞作为特洛伊木马来生存，复制、感染人类和动物并在全身繁殖的机制。最近对进化、遗传、宿主-病原体相互作用的生化方面重新引起了对巨噬细胞的广泛关注。

从小鼠组织中分离常驻巨噬细胞产率低且程序复杂，这对于许多功能性巨噬细胞的获得和研究来说困难重重，同时需要大量相对均一的细胞。这些都制约了原代巨噬细胞的相关研究。而一种重要且有效的替代方法就是用适当的生长因子在体外培养骨髓细胞，以此从骨髓前体细胞分化成大量巨噬细胞。但是制备小鼠骨髓来源的巨噬细胞存在操作复杂，制备率低，涉及试剂较多和周期长等制备问题。

小鼠骨髓来源的巨噬细胞是在巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)或l929上清(含巨噬细胞集落刺激因子)等存在下，对未分化的骨髓细胞进行体外分化获得的原代巨噬细胞，特别可以从转基因小鼠品系中获得相应的转基因小鼠原代巨噬细胞。因此，是广泛应用于免疫学和细胞生物学中体外研究中的优秀模型。

应用^[4][5]

用于PDK1靶向AKT调控小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的机制研究

PDK1对RANKL和MCSF诱导的小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化产生的影响,探索一条新的破骨细胞分化调控通路,有助于深入了解和认识破骨细胞相关骨质疏松症发生的分子生物学调节机制。

方法:(1)提取及培养C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞,破骨细胞诱导分化培养液连续诱导培养小鼠骨髓巨噬细胞6天,每天镜下观察破骨细胞生长情况及形态学变化,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)鉴定破骨细胞并计数;

(2) 破骨细胞诱导分化培养液分别诱导培养小鼠骨髓巨噬细胞0、2、4、6天,培养液中不含RANKL为对照组,两组分别在细胞培养的第0、2、4、6天分别提取细胞总RNA和总蛋白,实时荧光定量PCR检测PDK1mRNA的表达情况,BCA试剂盒测定蛋白浓度,免疫印迹法检测PDK1、AKT蛋白的表达及其磷酸化情况;

(3) Negative Control siRNA转染小鼠骨髓巨噬细胞,按照siRNA:lipofectamin2000为1:0.01-1:0.1(pmol:ul)比例范围寻找转染小鼠骨髓巨噬细胞siRNA的最佳浓度并计算转染效率;

(4) 设计合成三条PDK1-si RNA并分别转染小鼠骨髓巨噬细胞,转染48h后,提取各组(空白组、Negative Control siRNA组、PDK1-siRNA-1组、PDK1-siRNA-2组和PDK1-siRNA-3组)细胞的总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR检测各组PDK1 mRNA的表达情况,蛋白印迹法检测各组PDK1蛋白的表达情况;(5)Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测PDK1-si RNA对小鼠骨髓巨噬细胞增殖能力的影响。

参考文献

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[2]Molecular mechanisms of osteoporotic hip fractures in elderly women[J].Ursula F?ger-Samwald,Gyorgi Vekszler,Edith H?rz-Schuch,Sylvia Salem,Markus Wipperich,Peter Ritschl,Mehdi Mousavi,Peter Pietschmann.Experimental Gerontology.2015

[3]Daily or Cyclical Teriparatide Treatment in Women With Osteoporosis on no Prior Therapy and Women on Alendronate[J].Felicia Cosman,Jeri W.Nieves,Marsha Zion,Patricia Garrett,Simon Neubort,David Dempster,Robert Lindsay.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolis.2015(7)

[4]Epidemiology of fractures of the proximal third of the femur in elderly patients[J].Daniel Daniachi,Alfredo dos Santos Netto,Nelson Keiske Ono,Rodrigo Pereira Guimar?es,Giancarlo Cavalli Polesello,Emerson Kiyoshi Honda.Revista Brasileira de Ortopedia(English Edition).2015(4)

[5]何基琛.PDK1靶向AKT调控小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的机制研究[D].广西医科大学,2018.